防止质粒载体的自身连线，最常用于质粒进行单酶切连线时。
去磷酸化是由于DNA连线酶催化DNA连线时需要有磷酸基团的存在，载体在经酶切后会在切点端保留一个磷酸基团。
载体去磷酸化后因自身5'端无磷酸基团，因而不可以和自身3'端连线。但是，载体去磷酸化后3'还是有羟基的，可以与目的片段的5'端磷酸基团连线。载体的5'端和目的片断的3'-OH不能成键，因而形成一个双链各有一个切口的双链环状DNA，双链的切口会在转化入大肠桿菌后，在複製的过程中被修复。
若不进行去磷酸化处理，在连线反应中载体自身会优先进行连线，导致目的片段插入率降低。
