报告基因

特徵

（1）已被克隆和全序列已测定；

（2）表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；

（3）其表达产物能进行定量测定。

套用

植物基因工程

在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂硷合成酶基因（nos）、章鱼硷合成酶基因（ocs）、新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）、氯霉素乙醯转移酶基因（cat）、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、萤光酶基因等。nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农桿菌（Agrobacterium tumfaciens）的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农桿菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察萤光即可。nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰（磷酸化、乙醯化等），从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、萤光等进行检测。萤光酶基因（luc）是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2+、O2和萤光素存在下发出萤光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。

动物基因工程

在动物基因表达调控的研究中，报告基因也被广泛套用。常用的有氯霉素乙醯转移酶基因（cat）、β-半乳糖苷酶基因（LacZ）、二氢叶酸还原酶基因、萤光酶基因等。cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。萤光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的採用。

检测因子作用

可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。双杂交体系是由报告基因转录调控区、报告基因及一对可以相互作用的杂合反式作用因子组成。来从上述杂交体系中发展出的单一杂交体系技术，也是根据报告基因表达量的检测筛选出与已知顺式作用元件相结合的未知因子的DNA，该项技术正广泛套用于克隆细胞中含量微弱且用生化手段难以纯化的反式作用因子。

由此可知，报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位，它是作为外源目的基因能否转化植物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现已推广到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因这一探路者的作用会更明显。

列举

（2）氯霉素乙醯基转移酶（CAT）：该报告基因来源于大肠桿菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙醯基转移酶可催化乙醯CoA的乙醯基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、萤光素和酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbantassay，ELISA）检测其活性，也可进行蛋白质印迹（Westernblotting）和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，线性範围较窄，灵敏性较低。

（3）β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠桿菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报导基因之一。以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷（ONPG）为底物可用标準的比色法检测酶活性，其检测动力学範围为6个数量级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和萤光素二半乳糖苷（FDG）为底物则可用萤光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学（FACS）分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学範围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测萤光素酶活性的灵敏度相似。

（4）萤光素酶：萤光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性萤光素酶。最常用的萤光素酶有细菌萤光素酶、萤火虫萤光素酶和Renilla萤光素酶。细菌萤光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的套用中受到限制。萤火虫萤光素酶灵敏度高，检测线性範围宽达7～8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报导基因，用萤光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫萤光素酶的套用，无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla萤光素酶催化肠腔素（coelenterazine）氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将萤光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用萤光素酶检测系统灵敏方便地测定萤光素酶基因的表达。自1986年起，萤火虫萤光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的套用。Promega公司的pGL3及pGL2系列载体，含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。

萤光素酶报告基因有许多优点：①非放射性；②比CAT及其他报告基因速度快；③比CAT灵敏100倍；④萤光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3．5小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致萤光素酶活性的改变，而萤光素酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。萤光素酶浓度在10—16mol/L（10pS/L）到10-8mol/L（1mg/L）範围内，萤光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到l0-20mol/L的萤光素酶。Promega公司的萤光素酶检测系统比一般的方法灵敏及简单，产生的光稳定。

（5）分泌型硷性磷酸酶（SEAP）：SEAP是人胎盘硷性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP缺乏胎盘硷性磷酸酶羧基末端的24个胺基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐（PNPP）为底物时可用标準的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP可催化D—萤光素—O—磷酸盐水解生成D—萤光素，后者又可作为萤光素酶的底物，此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高，接近于萤光素酶报告基因的检测。还可用一步化学发光法检测酶活性。

（6）萤光蛋白家族：萤光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20 000～30 000的同源蛋白。绿色萤光蛋白(GFP）是套用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母（AequoreaVictoria）中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色萤光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。1991年克隆了GFP基因，已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体（red—shiftmutant），其萤光更强。其他突变体还有蓝色萤光蛋白（BFP）、增强型GFP(EGFP）和去稳定EGFP(destabilizedEGFP）等。红色萤光蛋白（RFP）是从珊瑚（Discosoma sp．）中分离的发光蛋白（drFP583或DsRed），可发射明亮的红色萤光。这些常用的报告基因也可被联合套用，同时检测2个甚至3个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学範围。稳定性好的报告基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。