MTT法--中文百科全书

基本介绍

又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚碸（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数範围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤葯物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

MTT缺点

由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的準确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

配製方法

通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓沖液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液裏的细菌，放4℃ 避光储存即可。在配製和储存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

注意事项

MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 範围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光储存两周内有效，或配製成5mg/ml储存在-20度长期储存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管裏，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那麽多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.

配製MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

PBS配方：

Nacl 8g

Kcl 0.2g

Na2HPO4 1.44g

KH2PO4 0.24g

调pH 7.4

定容1L

实验步骤

贴壁细胞

1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的葯物,原则上，细胞贴壁后即可加葯，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加葯.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况

3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若葯物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5、终止培养，小心吸去孔内培养液。

6、每孔加入150ul二甲基亚碸，置摇床上低速振蕩10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7、同时设定调零孔（培养基、MTT、二甲基亚碸），对照孔（细胞、相同浓度的葯物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚碸）

悬浮细胞

1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100(储存液100 1640）。

2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校準）测量各孔的吸光值）

4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚碸，置摇床上低速振蕩10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校準）测量各孔的吸光值。

5、同时设定调零孔（培养基、MTT、二甲基亚碸），对照孔（细胞、相同浓度的葯物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚碸），每组设定3复孔。